cy5 se -九游会ag

1. 产品简介：

      菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，其琥珀酰亚胺酯是最常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。通过改变次甲基链的长度, 可改变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照huoffman规则正好红移约100nm。

菁染料cy3和cy5已成为基因芯片的首选荧光标记物;另外,cy5, cy5.5和cy7的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。

2. 菁染料琥珀酰亚胺酯（cydye nhs）的标记

菁染料和生物分子的比例f/p=4～12之间荧光强度最高，f/p值过高荧光探针会自我淬灭并影响生物分子的生物活性，标记生物分子最好是用单琥珀酰亚胺酯，但是用双修饰的cydye nhs并没有发现交联。cydye nhs标记抗体在ph (8.5～9.4)时10分钟f/p可达5～6，而在ph 7.0几乎不反应。我们用不同比例的cy3标记anti-glutathione-s-transferase (gst)多克隆抗体发现用1:1, 5:1, 10:1 和20:1标记时得到的f/p值分别是0.28:1, 1.16:1, 2.3:1 和4.6:1。

3. 操作步骤

3.1 水溶性cy5 nhs标记(d-ser²)-leucine­enkephalin 

1.    cy5 nhs 1.0 mg 溶解于400 μl dmso后，加入到1ml 的玻璃瓶中盛有(d-ser²)-leucine-enkephalin acetate (ysgflt, 0.75 mg) 的400 μl dmso溶液。（dye 和peptide 投料比是1:1）

2.    然后加入15 μl三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。

3.    用hplc纯化蛋白，使用蛋白c18柱子(25 cm×10 mm)，每次上样注入2×400 μl，30分钟梯度洗脱从0.1% tfa水溶液到mecn∶h₂o（0.1% tfa）=70∶30，流速4ml /min。（对不同的蛋白选择不同的合适hplc梯度流动相）

4.    收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。

5.    产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光储存；必要时可用质谱表征。

6．cydye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的igg在4 ℃可避光保存2月；更长期的保存需加入等体积的甘油-20 ℃避光保存。

f/p计算：

cy5 在650 nm 的摩尔吸光系数为250 000 m^-1cm^-1，所用蛋白在280 nm处的摩尔吸光系数为170 000 m^-1cm^-1；cy5在280nm处的吸收是650nm处的5%。按以下公式计算f/p值。

 [cy5 dye] = (a₆₅₀)/250 000

 [peptide] =[a₂₈₀-(0.05×a₆₅₀)]/170 000

f/p _final= [dye]/[peptide]= {0.68×a₆₅₀}/ {a₂₈₀- (0.05×a₆₅₀)}