calcein am /pi试剂盒 -九游会ag

calcein am /pi试剂盒

cat：#30002；unit size #500 assays

钙黄绿素-am (calcein-am) 和碘化丙啶 (pi) 溶液，分别对活细胞和死细胞染色，可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。calcein-am的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管calcein-am本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，calcein-am能脱去am基，产生的calcein能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm，发射: 515 nm)。因此calcein-am仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的pi不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的dna双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm，发射: 617 nm)。由于calcein和pi-dna都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定calcein-am和pi的合适浓度。

i. 试剂  calcein-am 2mm 50ul in dmso;  ·pi (1.5mm) 150ul in water

ii. 用荧光显微镜观察细胞形态

以hela细胞染色为例，请注意不同的细胞种类、不同浓度，有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。

1. 染色溶液的配制

1) 用1 ml无水dmso溶解2 mg calcein-am，制备成2 mmol/l的calcein-am储备液，-20℃下密闭冷冻保存。

2) 用1 ml ddh2o溶解2 mg pi，制备成3 mmol/l的pi储备液，-20度下密闭冷冻保存，可以保存一年。

3) 将calcein-am储备液和pi储备液放置于室温。

4) 加5 µl calcein-am储备液和15 µl pi储备液至5 ml pbs中配制成染色溶液。calcein-am的终浓度为2 µmol/l，pi的终浓度为4.5 µmol/l。

2. 细胞染色

1) 染色hela细胞等贴壁细胞时，先用trypsin-edta等消化细胞，制备成细胞悬液。

2) 将细胞悬液离心3分钟 (1,000 rpm)。

3) 去除上清液，加入pbs缓冲液，细胞数量调整至10e5-10e6个/ml。再用移液器充分混匀。

4) 由于培养基中的血清等含有酯酶，calcein-am遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用pbs洗涤数次直到完全洗净。

5) 将200 µl细胞悬液移至小试管中，加入100 µl染色溶液，在37℃下孵育15分钟。

6) 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。

7) 在荧光显微镜下，先用490±10 nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。

3. 染色试剂的最佳浓度

   calcein-am和pi最佳浓度根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。

1) 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。

2) 用0.1-10 µm pi溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的pi浓度。

3) 用0.1-10 µm calcein-am溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的calcein-am浓度。接着用该浓度的calcein-am对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。

iii. 注意事项

1) calcein-am的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在-20度下密闭冷冻保存，防止水分进入。calcein-am储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。

2) 使用时一定要带手套、眼罩、口罩。万一接触到皮肤的话，迅速使用大量水清洗。